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實時熒光定量ＰＣＲ分析儀
定義
實時熒光定量ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ，ｑＰＣＲ）分析儀是一種用于在ＤＮＡ擴增過程中實時監測熒光信號的高精度分子生物學儀器。它結合了傳統ＰＣＲ的核酸擴增能力與熒光檢測技術，可對起始模板ＤＮＡ／ＲＮＡ進行精確定量、基因表達分析、病原體檢測等，是分子診斷、基因研究的核心設備。
核心工作原理
ＰＣＲ擴增基礎
通過溫度循環（變性→退火→延伸）在體外指數級擴增特定ＤＮＡ片段。
熒光標記與檢測
熒光探針／染料：在反應體系中加入熒光標記物（如ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、ＴａｑＭａｎ探針），其熒光強度與ＰＣＲ產物量成正比。
實時監測：每完成一次擴增循環，儀器通過光學系統檢測熒光信號，生成擴增曲線。
定量原理
Ｃｔ值（循環閾值）：熒光信號達到設定閾值時的循環數。Ｃｔ值與起始模板量成反比（模板越多，Ｃｔ值越小）。
標準曲線法：通過已知濃度的標準品建立Ｃｔ值－濃度對數曲線，計算未知樣本濃度。
儀器核心結構
| 組件 | 功能 |
|---|---|
| 熱循環模塊 | 精確控制溫度（±０．１℃），實現快速升降溫（可達６℃／秒）。 |
| 光學檢測系統 | 多通道熒光檢測器（常見４－６色），激發／發射濾光片切換，采集熒光信號。 |
| 反應模塊 | ９６孔／３８４孔反應板，兼容多種耗材（如０．２ｍＬ管、多聯管）。 |
| 控制系統 | 軟件驅動：設置程序（溫度、時間）、熒光通道、數據采集頻率。 |
| 數據分析軟件 | 自動計算Ｃｔ值、基因表達量（ΔΔＣｔ法）、熔解曲線分析、生成標準曲線等。 |
關鍵技術類型
熒光化學方法
莖環結構探針，僅與靶序列結合時發熒光，背景噪音低。
探針含報告／淬滅基團，擴增時水解釋放熒光，特異性極高。
結合雙鏈ＤＮＡ發熒光，成本低，但可能結合非特異產物（需熔解曲線驗證）。
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ：
水解探針（ＴａｑＭａｎ）：
分子信標（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ）：
多重檢測能力
多色熒光通道可同時檢測多個靶基因（如病原體分型、內參基因校正）。
核心應用領域
| 領域 | 應用場景 |
|---|---|
| 病原體檢測 | 病毒（如ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＩＶ）、細菌、真菌的快速定量診斷。 |
| 基因表達分析 | ｍＲＮＡ表達量測定（比較不同組織／藥物處理下的基因差異）。 |
| 基因分型與突變檢測 | ＳＮＰ分型、基因編輯（ＣＲＩＳＰＲ）效率驗證、癌癥驅動突變篩查。 |
| 轉基因檢測 | 食品／作物中轉基因成分定量。 |
| ｍｉｃｒｏＲＮＡ研究 | 短鏈ＲＮＡ定量（需特殊逆轉錄步驟）。 |
| 藥物研發 | 藥效基因靶點表達調控分析。 |
操作流程
樣本準備：提取ＤＮＡ／ＲＮＡ → 逆轉錄（ＲＮＡ樣本）。
反應體系配制：引物／探針、熒光染料、模板、聚合酶混合。
程序設置：
預變性（９５℃， ３０ｓ）→ 循環擴增（９５℃變性， ５ｓ → ６０℃退火／延伸， ３０ｓ， ４０次）→ 熔解曲線分析（６０℃→９５℃）。
數據分析：
軟件自動生成擴增曲線、熔解曲線、標準曲線，計算基因相對表達量（２＜ｓｕｐ＞－ΔΔＣｔ＜／ｓｕｐ＞）。
優勢與局限
| 優勢 | 局限性 |
|---|---|
| 高靈敏度（可檢測單拷貝基因） | 易受抑制劑影響（血色素、肝素等） |
| 寬動態范圍（跨越７－１０個數量級） | 引物／探針設計不當易導致假陰性 |
| 閉管操作，污染風險低 | 設備與試劑成本較高 |
| 快速（１－２小時完成檢測） | 需嚴格防ＲＮＡ降解（基因表達分析時） |
| 支持絕對定量與相對定量 | 依賴標準曲線（絕對定量需標準品） |
關鍵性能參數
溫控精度：±０．１℃（確保擴增特異性）。
檢測通道數：決定多重檢測能力（常見４－６通道）。
升降溫速率：＞５℃／秒可縮短反應時間。
靈敏度：可檢測低至１－１０拷貝的模板。
通量：９６孔板（中通量）ｖｓ． ３８４孔板（高通量）。
發展趨勢
數字化ＰＣＲ（ｄＰＣＲ）：
將樣本分割為微滴，實現絕對定量無需標準曲線，精度更高。
便攜式ｑＰＣＲ儀：
現場快速檢測（如機場、田間病原體篩查）。
自動化整合：
與核酸提取儀、液體處理工作站聯用，全流程無人操作。
多重檢測升級：
１６色以上通道，單次檢測數十種靶標。
使用注意事項
防污染措施：
分區操作（試劑準備區→樣本處理區→擴增區），使用ＵＮＧ酶防殘留污染。
質控設置：
陰性對照（無模板）、陽性對照、內參基因（如ＧＡＰＤＨ）。
熔解曲線驗證（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法）：
確保擴增產物單一，無非特異峰。
總結
實時熒光定量ＰＣＲ分析儀憑借其高靈敏度、定量準確性和操作便捷性，已成為分子診斷與生命科學研究的基石設備。從新冠疫情中的病毒載量監測，到癌癥基因的精準分型，其應用深度持續拓展。隨著數字化、便攜化與自動化技術的融合，ｑＰＣＲ技術將繼續推動精準醫療與即時檢測的發展。
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